用于荧光辅助数字计数分析的信号探针
荧光辅助的数字计数分析技术是指利用倒置荧光显微镜，可视化量化荧光探针数量，用于靶标定量检测的一类技术。目前，已有包括有机染料、量子点、纳米颗粒、微珠、dna纳米结构等多种荧光标记探针被报道。然而，这些探针普遍存在亮度低、尺寸小、制备工艺复杂等缺点，在实际应用中易导致检测灵敏度低、成像设备要求高及重复性差等不足。工程化肿瘤细胞作为一种新型生物工具，现已成功应用于肿瘤治疗、纳米药物递送和纳米材料合成等领域，这些工作为构筑荧光单细胞探针提供有利理论依据。
近期，广西师范大学张亮亮、胡盛强课题组与安阳师范学院高凤丽课题组合作提出使用功能化磁性纳米颗粒来定性修饰荧光染色的肿瘤细胞，用于构筑磁性荧光单细胞探针。结合荧光辅助的数字计数策略，量化靶标依赖的结合或剪切事件，以期实现靶标灵敏、快速分析。相关成果以“engineered cancer cells as signal probes for fluorescence-assisted digitalcounting analysis”为题发表在国际化学权威期刊analytical chemistry上。
在该项研究中，研究人员首先选择适配体功能化的磁性纳米粒子与荧光染色的肿瘤细胞共培养，初步尝试磁性荧光单细胞探针构筑的可能性。细胞成像结果表明，微米级肿瘤细胞表面明显覆盖一层磁性纳米粒子涂层，且细胞形貌保持不变，该结果有利证明荧光单细胞探针的成功构筑。不同于适配体与细胞膜蛋白特异性相互作用，基于细胞膜磷脂双分子层结构的非选择性亲疏水作用也可为磁性荧光单细胞探针构筑提供另一种可能。除细胞膜表面天然受体外，选择合适的化学修饰策略，在细胞表面引入人工受体，也可以用于构筑荧光单细胞探针。
图1：（a）fe₃o₄ nps的tem图；（b）ramos细胞共聚焦图；（c）荧光单细胞探针构筑示意图；（d）明场、（e）hoechst33342通道及（f）叠场单细胞探针荧光成像图
图2：（a）荧光单细胞探针的不同构筑策略；（b）同时构筑fe₃o₄-ramos和fe₃o₄-ccrf-cem荧光单细胞
随后，研究人员利用所构筑的荧光单细胞探针构建荧光辅助的数码计数平台。作为概念验证实验，研究人员通过合理设计适配体序列，引入核酸外切酶iii（exo iii）识别位点。通过可视化计算exo iii加入前后荧光单细胞探针数量，来量化靶标依赖的剪切事件，从而实现exo iii活性的间接数字检测。此外，基于适配体的特异性识别与连接作用，研究人员选择适配体功能化的磁性纳米粒子来直接检测肿瘤细胞。
图3：（a）exo iii活性数码计数分析示意图；（b）琼脂糖凝胶电泳图；（c）不同浓度exo iii下fe₃o₄-ramos单细胞探针的共聚焦荧光显微镜图像；（d）fe₃o₄-ramos单细胞探针数量与exoiii浓度的关系曲线；（e）选择性实验图
综上所述，该研究开发了一种新颖的荧光辅助数字计数策略，用于高灵敏、选择性分析。相较于传统的荧光探针，荧光单细胞探针在数字计数分析方面具有以下优势：（1）明亮的荧光和大尺寸能够对每个靶标结合事件做出高保真的响应；（2）多种细胞工程方法为合理设计单细胞探针提供了多种选择；（3）可以实现肿瘤细胞的直接定量检测；（4）具有多种靶标同时数字计数分析的潜力。
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图1：（a）fe₃o₄ nps的tem图；（b）ramos细胞共聚焦图；（c）荧光单细胞探针构筑示意图；（d）明场、（e）hoechst33342通道及（f）叠场单细胞探针荧光成像图
图2：（a）荧光单细胞探针的不同构筑策略；（b）同时构筑fe₃o₄-ramos和fe₃o₄-ccrf-cem荧光单细胞
随后，研究人员利用所构筑的荧光单细胞探针构建荧光辅助的数码计数平台。作为概念验证实验，研究人员通过合理设计适配体序列，引入核酸外切酶iii（exo iii）识别位点。通过可视化计算exo iii加入前后荧光单细胞探针数量，来量化靶标依赖的剪切事件，从而实现exo iii活性的间接数字检测。此外，基于适配体的特异性识别与连接作用，研究人员选择适配体功能化的磁性纳米粒子来直接检测肿瘤细胞。
图3：（a）exo iii活性数码计数分析示意图；（b）琼脂糖凝胶电泳图；（c）不同浓度exo iii下fe₃o₄-ramos单细胞探针的共聚焦荧光显微镜图像；（d）fe₃o₄-ramos单细胞探针数量与exoiii浓度的关系曲线；（e）选择性实验图
综上所述，该研究开发了一种新颖的荧光辅助数字计数策略，用于高灵敏、选择性分析。相较于传统的荧光探针，荧光单细胞探针在数字计数分析方面具有以下优势：（1）明亮的荧光和大尺寸能够对每个靶标结合事件做出高保真的响应；（2）多种细胞工程方法为合理设计单细胞探针提供了多种选择；（3）可以实现肿瘤细胞的直接定量检测；（4）具有多种靶标同时数字计数分析的潜力。
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