基于胶原蛋白的柔性基底溶解微针设计
为了预防和逆转皮肤衰老及治疗皮肤病，人们做了很多努力，其中抗糖化食品、化妆品、能量皮肤嫩肤、口服胶原蛋白、真皮注射填充剂等显示出一定的效果。然而，大多数方法都有一定的缺点。生物相容性聚合物微针（mns）正在成为一种新型的无痛、无创、高效的经皮给药平台，美容应用是mns成功应用的最有前途的领域之一。
基于此，来自沈阳药科大学的凌桂霞、张鹏共同开发出一种快速溶解的微针（dmn）贴片。采用两步铸模法，以皮肤细胞中所含的水解胶原蛋白（hc）为主要原料，以简单、微创的方式递送胶原蛋白，使被封装的药物在皮肤中释放。通过优化hc和辅助支撑材料的配方和比例，获得了刺穿皮肤所需的机械强度，同时柔软的基底允许应用的灵活性。dmns可在15分钟内完全溶解在皮肤中，约8小时内释放，并且在使用时不会产生毒性和刺激。与口服和外用的效果不佳，以及经皮注射的高风险相比，载药的hc dmns克服了传统方法直接渗透和微创的缺点，使治疗高效和安全。hc dmns的成功制备和研究在该领域具有创新和现实意义，有望成为一种简单、有效、大众化的化妆品透皮给药平台。相关论文以“collagen-based dissolving microneedles with flexible pedestals: a transdermal delivery system for both anti-aging and skin diseases”为题发表在advanced healthcare materials期刊上。
针对目前药妆领域的发展现状，该研究旨在以hc为主要基质，结合几种常用的生物相容性材料，克服hc单独机械强度差的缺点，筛选制备一种贴合皮肤的柔性基底dmn贴片，用于胶原蛋白输送，改善皮肤质量。将烟酰胺进一步加载到mns中，与简单的hc dmns相比，有望同时实现逆转皮肤衰老和治疗皮肤病的双重效果（图1）。
图1 mn贴片的制备过程及其在面部抗衰老中的应用
空白dmns的制备
用hc与5种聚合物结合的溶液制备dmns阵列。结果表明，hc/海藻酸钠（sa）是制备dmns的最佳配方。如图2所示，展示了微针正面的直观照片和显微图像（正面、侧面）。
图2 mn的直观照片和显微图像（正面、侧面）
带柔性基底的负载烟酰胺dmns的制备
为了制备负载烟酰胺的柔性基底dmn贴片，采用了两步铸造工艺。在第一步中，将药物和hc/sa溶液的混合物填充到聚二甲基硅氧烷（pdms）模具中形成尖端。其次，将聚乙烯醇（pva）涂覆到模具中形成基底（图3）。贴片由高度为1000 μm，底部宽度为500 μm的矩形金字塔针组成。用数码相机拍摄的照片显示pva基底柔软且有弹性（图4b）。此外，扫描电镜（sem）图像证实，dmn的尖端是锋利的，没有任何可见的断裂（图4c和4d）。
图3 柔性基底dmns的制造工艺
图4 dmns的形态
傅里叶变换红外光谱（ftir）
图5显示了烟酰胺、hc/sa空白dmns和负载烟酰胺的hc/sa dmns的三个不同的红外（ir）光谱。结果显示，在光谱中观察到hc、sa和烟酰胺的特征吸收峰。在dmns的形成过程中没有新的明显吸收峰，烟酰胺在hc/sa dmns中没有降解和结构变化，表明该药物与聚合物之间没有不相容，意味着成功地制备了烟酰胺负载hc/sa dmns。并且dmns中的药物含量没有减少，从而确保了mns在使用过程中能够发挥预期的功能。
图5 烟酰胺、hc/sa dmn和hc/sa dmn负载烟酰胺的ftir光谱
力学测试
为了在临床上成功、正确地使用mns，需要在不弯曲、不断裂的情况下植入皮肤内。因此，机械强度对mns的插入具有重要意义。如图6所示，所制备的dmn可以承受每针12 n和0.12 n的力，超过了人体皮肤植入所需的力（≈ 0.1n），表明机械强度很高。
图6 电子万能试验机原理图（左）和dmn贴片在垂直力作用下的力学行为图（右）
皮肤渗透性能和渗透深度
如图7a和b所示，dmn贴片被插入锡箔中。去除后，锡箔上留下了完整的微孔阵列，而dmn尖端在显微镜下观察时仍保持其原始形状，几乎没有损伤。结果表明，dmn贴片具有一定的植皮能力。为了进一步验证dmn贴片的植皮能力，以新鲜猪皮为材料，考察了dmn贴片的植皮能力。结果如图7c所示。当含有台盼蓝的dmn贴片被插入猪皮肤时，皮肤上留下了完整的蓝色微孔阵列。由此可见，mn贴片能成功穿透角质层，皮肤穿刺率可达100%。植入深度为dmns植入处大鼠皮肤切片，苏木精-伊红（h&e）染色。如图7d所示，组织切片可以很容易地显示dmns产生的微孔，针可以刺穿皮肤并产生更深的微通道，深入真皮。
图7 dmns的插入能力
dmns的体内外快速溶出
在体外，将dmn插入制备的琼脂糖凝胶中，在不同的时间点取出，在显微镜下观察。dmns的溶解过程如图8a所示。可以看到dmns在凝胶中迅速溶解，针的所有部分在3分钟内溶解。在体内，将具有柔性基底的dmn植入剃毛大鼠的背部皮肤，并在不同时间点取出。dmns的溶解过程如图8b所示。dmns植入皮肤后开始溶解，整个dmns在15分钟内完全溶解。这两个结果都表明hc/sa dmns具有快速溶解的能力。
图8 dmns的体内外快速溶出
皮肤安全性和溶血
如图9a所示，去除贴片后，应用dmns的皮肤表面出现了明显的微孔和局部红斑，但没有明显的肿胀。随着时间的延长，红斑消失，皮肤表面几乎恢复到原来的状态。还进行了溶血试验，以评估实际使用中负载烟酰胺的dmns的潜在毒性效应。图9b显示了该实验的结果。结果表明，烟酰胺mn溶液无任何毒性，与红细胞孵育后的上清液如图所示。因此，烟酰胺和hc/sa dmns经皮给药是安全的。
图9 皮肤安全性和溶血
含量测定及体外透皮吸收能力评价
采用franz扩散细胞法研究了烟酰胺dmns和乳膏在大鼠皮肤中的通透性。结果如图10所示，dmns制剂中烟酰胺的累积释放量明显高于乳霜制剂。hc/sa dmns在8 h内释放约52%的烟酰胺，而乳膏制剂在8 h内仅释放约25.6%。烟酰胺在接受池的累积透皮释放量（%）为52%，说明残留的48%可产生局部效应。
图10 烟酰胺dmns的体外透皮释放与乳膏应用的比较
羟脯氨酸的测定
如图11所示，与未处理的对照组相比，mn组皮肤的水解和颜色发育显示羟基脯氨酸水平（通常被认为代表胶原蛋白的产生量）增加。此外，显微镜下观察应用于大鼠皮肤的dmn阵列，只留下针根甚至消失，表明hc针尖已经溶解在皮肤中，这也证明了胶原蛋白成功递送到皮肤。
图11 对照组和实验组皮肤羟脯氨酸含量
综上所述，该研究筛选了几种以胶原为主要成分制备dmns的配方，确定16% w/v hc/sa（7:3）的溶液最适合制备形态完整、机械强度好、成本合适的胶原dmns。pva制备的基底使mn易于弯曲并贴合皮肤。此外，该研究首次证明在dmns中添加烟酰胺是可行的。负载烟酰胺的mns阵列可以穿透猪和大鼠的皮肤，达到一定的深度，实现胶原蛋白的真皮递送。同时，其溶出速度快，生物安全性高，使用方便，附着力强。此外，烟酰胺在dmns中的皮肤渗透性优于乳膏制剂，渗透性为52%，保留率为48%。因此，无论是经皮给药还是局部作用，将来都有一定的效果。在体内抗衰老效果评价中，胶原蛋白mns也初步显示出提高皮肤胶原蛋白含量的能力。在移除dmn贴片后，皮肤自然愈合，没有任何感染迹象。
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图1 mn贴片的制备过程及其在面部抗衰老中的应用
空白dmns的制备
用hc与5种聚合物结合的溶液制备dmns阵列。结果表明，hc/海藻酸钠（sa）是制备dmns的最佳配方。如图2所示，展示了微针正面的直观照片和显微图像（正面、侧面）。
图2 mn的直观照片和显微图像（正面、侧面）
带柔性基底的负载烟酰胺dmns的制备
为了制备负载烟酰胺的柔性基底dmn贴片，采用了两步铸造工艺。在第一步中，将药物和hc/sa溶液的混合物填充到聚二甲基硅氧烷（pdms）模具中形成尖端。其次，将聚乙烯醇（pva）涂覆到模具中形成基底（图3）。贴片由高度为1000 μm，底部宽度为500 μm的矩形金字塔针组成。用数码相机拍摄的照片显示pva基底柔软且有弹性（图4b）。此外，扫描电镜（sem）图像证实，dmn的尖端是锋利的，没有任何可见的断裂（图4c和4d）。
图3 柔性基底dmns的制造工艺
图4 dmns的形态
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图5显示了烟酰胺、hc/sa空白dmns和负载烟酰胺的hc/sa dmns的三个不同的红外（ir）光谱。结果显示，在光谱中观察到hc、sa和烟酰胺的特征吸收峰。在dmns的形成过程中没有新的明显吸收峰，烟酰胺在hc/sa dmns中没有降解和结构变化，表明该药物与聚合物之间没有不相容，意味着成功地制备了烟酰胺负载hc/sa dmns。并且dmns中的药物含量没有减少，从而确保了mns在使用过程中能够发挥预期的功能。
图5 烟酰胺、hc/sa dmn和hc/sa dmn负载烟酰胺的ftir光谱
力学测试
为了在临床上成功、正确地使用mns，需要在不弯曲、不断裂的情况下植入皮肤内。因此，机械强度对mns的插入具有重要意义。如图6所示，所制备的dmn可以承受每针12 n和0.12 n的力，超过了人体皮肤植入所需的力（≈ 0.1n），表明机械强度很高。
图6 电子万能试验机原理图（左）和dmn贴片在垂直力作用下的力学行为图（右）
皮肤渗透性能和渗透深度
如图7a和b所示，dmn贴片被插入锡箔中。去除后，锡箔上留下了完整的微孔阵列，而dmn尖端在显微镜下观察时仍保持其原始形状，几乎没有损伤。结果表明，dmn贴片具有一定的植皮能力。为了进一步验证dmn贴片的植皮能力，以新鲜猪皮为材料，考察了dmn贴片的植皮能力。结果如图7c所示。当含有台盼蓝的dmn贴片被插入猪皮肤时，皮肤上留下了完整的蓝色微孔阵列。由此可见，mn贴片能成功穿透角质层，皮肤穿刺率可达100%。植入深度为dmns植入处大鼠皮肤切片，苏木精-伊红（h&e）染色。如图7d所示，组织切片可以很容易地显示dmns产生的微孔，针可以刺穿皮肤并产生更深的微通道，深入真皮。
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图8 dmns的体内外快速溶出
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图9 皮肤安全性和溶血
含量测定及体外透皮吸收能力评价
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图10 烟酰胺dmns的体外透皮释放与乳膏应用的比较
羟脯氨酸的测定
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图11 对照组和实验组皮肤羟脯氨酸含量
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