核酸适配体检测原理 可生成具有所需结合亲和力的适配体
核酸适配体是一种短的单链dna或rna分子，其具有稳定性高、结合能力强、便于修饰、成本低等优点，被广泛应用于制作各种靶标分子的生物传感器。传统的适配体筛选采用指数富集法（selex），即通过反复的筛选和扩增，从单链寡核苷酸库中富集出与靶标结合的适配体。该方法无法定量生产所需结合亲和力的适配体，且耗时耗力。近些年来研究者们开发了如ce-selex、non-selex以及m-selex等技术，提高了适配体的筛选效率，但仍无法定量生成具有特定结合亲和力的适配体。
近期，美国西北大学的shana o. kelley教授团队开发了一种名为“pro-selex”的新方法，用于定量分离具有可编程结合亲和力的适配体。该工作以“a high-dimensional microfluidic approach forselection of aptamers with programmable binding affinities”为题，发表在nature chemistry期刊上。
pro-selex的整体流程如图1a所示，首先将单链寡核苷酸库转化为单克隆适配体粒子（ap），在每个粒子的表面展示了单个核酸序列的多个拷贝，产生ap文库。然后将其与不同浓度的靶标一起进行孵育，使用微流控芯片分离具有不同靶结合水平的ap，进行测序分析，鉴定出具有不同结合亲和力的适配体。具体的分选方法如图1b所示，ap文库与生物素化的靶标结合后，再用抗生物素磁性纳米颗粒（mnp）去标记靶标，将结合了靶标的适配体粒子赋予磁性，随后送至微流控装置中分选。该微流控装置分为四个区，当外界设定流量q相同时，四个区域会因截面积a的不同而展现出不同的流速v（即q=a*v）。第一区流速最大，若适配体与靶标结合能力强，则其磁性高，磁力能够克服流体高流速产生的拖曳力，则被保留下来。而亲和力较低的适配体粒子因磁性较弱，无法克服拖曳力而被带到下一个区域。后三个区域流速递减，同理可根据不同的亲和力进行分选（图1c, d）。该微流控芯片的流量是可调整的，具备可编程性（图1e）。
图1 微流控方法定量分离不同结合亲和力的适配体
接下来，研究人员将该方法用于分选凝血酶适配体。在核酸文库中，同种适配体对靶标的亲和力存在差异。以03适配体为例，研究人员首先测试了该微流控芯片是否可以分类不同靶结合水平的ap（图2a）。将ap与不同浓度的靶标共同孵育并用磁珠标记（图2b），分别在两种不同的流量下对这些粒子进行分选（图2c、2d）。在8 ml/h的流量下，高磁性粒子主要被捕获在芯片的1区，当流量增加到16 ml/h时，部分移动到2区，而低磁性粒子主要聚集在后面的区，几乎所有的非靶结合粒子都在w区中被检测到。上述结果表明，该微流控芯片能够根据ap的靶结合水平对其进行分类和捕获，其中靶标浓度对分离效率起着显著的作用。此外，不同适配体（03和tba）对靶标的亲和力也不同。研究人员分别采用流式细胞仪（图2e~2g）及pro-selex芯片筛选（图2h~2j），结果也证实了该芯片能够分选不同亲和力的ap。
图2 pro-selex分选性能验证
然后，研究人员研究了pro-selex平台是否能高效地筛选适配体。以人髓过氧化物酶（mpo）作为模型，ap文库在5种mpo浓度下以两种流量进行测试，分离出不同亲和力的适配体（图3a）。结果表明，该微流控芯片捕获的ap组分随着目标浓度的降低而减少（图3b）。而当流量升高时，ap库的分选布局发生了变化（图3c），突出了该方法的高分辨率。随后，研究人员将收集到的dna文库进行高通量测序，并创建了一种评分工具，用于分析适配体的富集倍数并产生z分数（图3d、3e）。此外，研究人员还随机选择了八种适配体测定其kd（图3f），通过曲线拟合发现它们的kd值与z分数之间存在线性关系（图3g），表明z评分可用于筛选特定亲和力的适配体。
图3 使用pro-selex筛选mpo适配体
最后，研究人员探究了z分数是否可以用于定量筛选具有所需结合亲和力的适配体。基于z分数和适配体的kd值之间的相关性产生“检索带”（图4a）。通过评估不同z分数范围内多个适配体的结合亲和力，“十分匹配”的成功率在20%到50%之间。表明在z分数范围内测试不超过5个候选适配体，就可识别出一个具有所需结合亲和力的适配体（图4b）。mpo的四种特定亲和力的适配体成功被筛选出来（图4c）。
图4 定量分选具有所需亲和力的mpo适配体
总结来说，该研究开发了一种新的适配体筛选方法，其能够高效、定量地生成具有所需结合亲和力的适配体。pro-selex方法具备可编程性，可捕获从小分子到病毒或细菌的各种靶标，具备广阔的应用前景。
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pro-selex的整体流程如图1a所示，首先将单链寡核苷酸库转化为单克隆适配体粒子（ap），在每个粒子的表面展示了单个核酸序列的多个拷贝，产生ap文库。然后将其与不同浓度的靶标一起进行孵育，使用微流控芯片分离具有不同靶结合水平的ap，进行测序分析，鉴定出具有不同结合亲和力的适配体。具体的分选方法如图1b所示，ap文库与生物素化的靶标结合后，再用抗生物素磁性纳米颗粒（mnp）去标记靶标，将结合了靶标的适配体粒子赋予磁性，随后送至微流控装置中分选。该微流控装置分为四个区，当外界设定流量q相同时，四个区域会因截面积a的不同而展现出不同的流速v（即q=a*v）。第一区流速最大，若适配体与靶标结合能力强，则其磁性高，磁力能够克服流体高流速产生的拖曳力，则被保留下来。而亲和力较低的适配体粒子因磁性较弱，无法克服拖曳力而被带到下一个区域。后三个区域流速递减，同理可根据不同的亲和力进行分选（图1c, d）。该微流控芯片的流量是可调整的，具备可编程性（图1e）。
图1 微流控方法定量分离不同结合亲和力的适配体
接下来，研究人员将该方法用于分选凝血酶适配体。在核酸文库中，同种适配体对靶标的亲和力存在差异。以03适配体为例，研究人员首先测试了该微流控芯片是否可以分类不同靶结合水平的ap（图2a）。将ap与不同浓度的靶标共同孵育并用磁珠标记（图2b），分别在两种不同的流量下对这些粒子进行分选（图2c、2d）。在8 ml/h的流量下，高磁性粒子主要被捕获在芯片的1区，当流量增加到16 ml/h时，部分移动到2区，而低磁性粒子主要聚集在后面的区，几乎所有的非靶结合粒子都在w区中被检测到。上述结果表明，该微流控芯片能够根据ap的靶结合水平对其进行分类和捕获，其中靶标浓度对分离效率起着显著的作用。此外，不同适配体（03和tba）对靶标的亲和力也不同。研究人员分别采用流式细胞仪（图2e~2g）及pro-selex芯片筛选（图2h~2j），结果也证实了该芯片能够分选不同亲和力的ap。
图2 pro-selex分选性能验证
然后，研究人员研究了pro-selex平台是否能高效地筛选适配体。以人髓过氧化物酶（mpo）作为模型，ap文库在5种mpo浓度下以两种流量进行测试，分离出不同亲和力的适配体（图3a）。结果表明，该微流控芯片捕获的ap组分随着目标浓度的降低而减少（图3b）。而当流量升高时，ap库的分选布局发生了变化（图3c），突出了该方法的高分辨率。随后，研究人员将收集到的dna文库进行高通量测序，并创建了一种评分工具，用于分析适配体的富集倍数并产生z分数（图3d、3e）。此外，研究人员还随机选择了八种适配体测定其kd（图3f），通过曲线拟合发现它们的kd值与z分数之间存在线性关系（图3g），表明z评分可用于筛选特定亲和力的适配体。
图3 使用pro-selex筛选mpo适配体
最后，研究人员探究了z分数是否可以用于定量筛选具有所需结合亲和力的适配体。基于z分数和适配体的kd值之间的相关性产生“检索带”（图4a）。通过评估不同z分数范围内多个适配体的结合亲和力，“十分匹配”的成功率在20%到50%之间。表明在z分数范围内测试不超过5个候选适配体，就可识别出一个具有所需结合亲和力的适配体（图4b）。mpo的四种特定亲和力的适配体成功被筛选出来（图4c）。
图4 定量分选具有所需亲和力的mpo适配体
总结来说，该研究开发了一种新的适配体筛选方法，其能够高效、定量地生成具有所需结合亲和力的适配体。pro-selex方法具备可编程性，可捕获从小分子到病毒或细菌的各种靶标，具备广阔的应用前景。
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