基于树枝状硼亲和材料的多功能微流控平台
硼亲和材料对顺式二醇类物质具有独特的亲和性，已成为糖蛋白富集的有力手段。然而，硼酸和顺式二醇基团之间的亲和力比免疫亲和相互作用低3-6个数量级，导致其吸附能力受限。据报道，具有高度支化结构的硼亲和材料能够将其与糖蛋白的结合能力提高2-3个数量级。八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷（ov-poss）具有八个中心点且具有向外辐射的三维笼状结构，可以聚合形成树枝状结构聚合物，高密度活性位点均匀分布于聚合物骨架表面，从而与目标物官能团产生强结合作用。
近期，天津医科大学刘照胜、黄艳萍教授课题组报道了一种利用树枝状八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷（ov-poss）提高硼亲和位点可及性来特异性富集糖肽和糖蛋白的新策略，并将制备的硼亲和整体柱用作微流控平台的一部分，实现了蛋白质的在线分级、变性、酶解以及糖肽、泛素化肽的富集。相关成果以“boronate avidity assisted by dendrimer-like polyhedral oligomericsilsesquioxanes for a microfluidic platform for selective enrichment ofubiquitination and glycosylation”为题发表在国际化学权威杂志analytical chemistry上。
首先，研究人员提出以ov-poss为核心形成树枝状聚合物的交联策略。将3-（丙烯酰胺基）苯基硼酸（aapba）作为功能单体，制备出具有高硼亲和位点密度的聚（aapba-co-ov-poss-co-edma）整体柱（图1）。
图1 基于ov-poss的树枝状硼亲和整体柱和传统硼亲和整体柱对比示意图
随后，研究人员比较了ov-poss交联和不含ov-poss整体柱的吸附能力，结果表明聚（aapba-co-ov-poss-co-edma）整体柱的吸附容量是常规非ov-poss交联整体柱的27倍（图2a）。通过糖蛋白（hrp、trf）和腺苷的结合强度测定发现，与trf（4个糖基化位点）和腺苷（1个糖基）相比，该树枝状硼亲和材料对糖基数量多的hrp（9个糖基化位点）亲和能力分别提高3个数量级和4个数量级（图2b−d）。证明树枝状硼亲和材料更有利于硼酸官能团协同结合多糖修饰的糖蛋白。
图2 （a）聚（aapba-co-ov-poss-co-edma）整体柱和不含ov-poss整体柱对hrp的吸附等温线；聚（aapba-co-ov-poss-co-edma）整体柱与（b）hrp、（c）trf和（d）腺苷结合的scatchard图
接下来，研究人员用sds-page和maldi-tof ms光谱研究了对糖蛋白和糖肽的特异性。如图3a所示，bsa和hrp混合液经过聚（aapba-co-ov-poss-co-edma）整体柱处理后，非糖蛋白bsa条带消失，表明该材料对糖蛋白优异的选择性。此外，hrp酶解液富集实验中，未经富集的酶解液中仅检测到1种糖肽（图3b），而经过富集后，以更高的信噪比检测到23种糖肽（图3c）。
图3 糖蛋白和糖肽的特异性评估：（a）sds-page分析：泳道1：标准分子量；泳道2：蛋白质混合物；泳道3：上样流出液；泳道4：淋洗液；泳道5：洗脱液；（b）未富集和（c）富集后胰蛋白酶hrp消化液
最后，将该树枝状硼亲和整体柱用于构建多功能微流控芯片平台，在线处理小鼠肝脏蛋白质，该平台集成了蛋白质分级、变性、酶水解和糖肽和泛素肽富集五个功能区（图4）。与离线方法相比，蛋白质样品预处理时间减少近一半，且新鉴定到86.7%的糖肽、75%的糖蛋白、100%的泛素肽和95.8%的泛素化蛋白。
图4 微流控芯片集成平台的示意图
研究人员首次证明了ov-poss辅助硼酸单体形成树枝状结构的策略，能够显著提高硼亲和材料的亲和力和位点可及性。最后，将该硼亲和整体柱应用于构建微流控芯片平台，实现了蛋白质样品的在线预处理，以及糖肽和泛素肽的同时鉴定。开发的微流控平台为蛋白质组学的自动化、高效、高通量分析提供一种有前途的工具。
论文链接： https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c04005
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图1 基于ov-poss的树枝状硼亲和整体柱和传统硼亲和整体柱对比示意图
随后，研究人员比较了ov-poss交联和不含ov-poss整体柱的吸附能力，结果表明聚（aapba-co-ov-poss-co-edma）整体柱的吸附容量是常规非ov-poss交联整体柱的27倍（图2a）。通过糖蛋白（hrp、trf）和腺苷的结合强度测定发现，与trf（4个糖基化位点）和腺苷（1个糖基）相比，该树枝状硼亲和材料对糖基数量多的hrp（9个糖基化位点）亲和能力分别提高3个数量级和4个数量级（图2b−d）。证明树枝状硼亲和材料更有利于硼酸官能团协同结合多糖修饰的糖蛋白。
图2 （a）聚（aapba-co-ov-poss-co-edma）整体柱和不含ov-poss整体柱对hrp的吸附等温线；聚（aapba-co-ov-poss-co-edma）整体柱与（b）hrp、（c）trf和（d）腺苷结合的scatchard图
接下来，研究人员用sds-page和maldi-tof ms光谱研究了对糖蛋白和糖肽的特异性。如图3a所示，bsa和hrp混合液经过聚（aapba-co-ov-poss-co-edma）整体柱处理后，非糖蛋白bsa条带消失，表明该材料对糖蛋白优异的选择性。此外，hrp酶解液富集实验中，未经富集的酶解液中仅检测到1种糖肽（图3b），而经过富集后，以更高的信噪比检测到23种糖肽（图3c）。
图3 糖蛋白和糖肽的特异性评估：（a）sds-page分析：泳道1：标准分子量；泳道2：蛋白质混合物；泳道3：上样流出液；泳道4：淋洗液；泳道5：洗脱液；（b）未富集和（c）富集后胰蛋白酶hrp消化液
最后，将该树枝状硼亲和整体柱用于构建多功能微流控芯片平台，在线处理小鼠肝脏蛋白质，该平台集成了蛋白质分级、变性、酶水解和糖肽和泛素肽富集五个功能区（图4）。与离线方法相比，蛋白质样品预处理时间减少近一半，且新鉴定到86.7%的糖肽、75%的糖蛋白、100%的泛素肽和95.8%的泛素化蛋白。
图4 微流控芯片集成平台的示意图
研究人员首次证明了ov-poss辅助硼酸单体形成树枝状结构的策略，能够显著提高硼亲和材料的亲和力和位点可及性。最后，将该硼亲和整体柱应用于构建微流控芯片平台，实现了蛋白质样品的在线预处理，以及糖肽和泛素肽的同时鉴定。开发的微流控平台为蛋白质组学的自动化、高效、高通量分析提供一种有前途的工具。
论文链接： https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c04005
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